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环保知识

厌氧氨氧化的前世今生

发布时间:2020年09月11日 16:51 作者:环保工程师 点击数:次

来源:环保工程师


 

在1986年之前,人们都不相信有可在厌氧环境下“氧化”氨氮的细菌。一个荷兰生物工程师和一个微生物教授的偶遇改变了一切。到了1999年7月,这位微生物学家连同其他几位学者,在《Nature》期刊上宣布了一个重大发现:“厌氧氨氧化”菌属于浮霉菌门。在日后关于anammox的文章里,这个人的名字会被反复引用,他的名字叫Gijs Kuenen。

如果你不知道Gijs Kuenen是谁的话,那说明你对厌氧氨氧化的历史还知之甚少。如果说谁最有资格为厌氧氨氧化作传,那可能是非Gijs Kuenen教授莫属。幸运的是,Kuenen教授最近还真的将过去40年厌氧氨氧化史好好地梳理了一遍,并发表在2020年第二期的《Environmental Microbiology》上,题为《Anammox and Beyond》。

从硫细菌说起

1940年12月9日,Gijs Kuenen出生于荷兰阿姆斯特丹西边的小城Heemstede。1972年,Kuenen教授在格罗宁根大学获得微生物学博士学位。毕业后他在美国洛杉矶和荷兰格罗宁根辗转了几年,随后在1980年来到代尔夫特,成为了荷兰代尔夫特理工大学TU Delft的第四任微生物教授。前三人都是代尔夫特理工的传奇人物,包括Martinus Beijerinck、Albert Kluyver和Cornelis van Niel。

Kuenen教授说,每次回想,都让他愈发感觉微生物界各种人和事之间奇妙的联系。他说关于anammox的故事可以从他在格罗宁根大学读本科的时候说起。当时这门课的授课老师是Hans Veldkamp教授(1923-2002),Veldkamp的导师则是Albert Kluyer (圈子的传承)。

在为期六周的微生物课里,他学会了如何对多种微生物和代谢类型进行富集培养,而这种方法正是TU Delft首任微生物教授Martinus Beijerinck发明的。后来Veldkamp教授则成为了Kuenen教授博士学位的导师。他的博士论文是关于两种硫氧化菌(SOB)的比较。在此后很长的一段时间里,他的研究都是围绕SOB展开的。

在1980年他回到Delft之后,他开始寻求SOB在工业上的应用。巧合的是,当时荷兰瓦赫宁根大学的Gatze Lettinga教授正在研究污水的厌氧处理技术。两位教授联合本地一家叫Paques的小公司,成功地开发了生物脱硫工艺,去除污水中的硫化氢,并回收单质硫。

Paques公司后来也将这项工艺技术商业化,取名THIOPAQ。取名者正是Kuenen和Lettinga联合培养的博士生Cees Buisman,后来他也成为了瓦大环境系的教授。

在大学当教授之余,当时Kuenen每周会抽几小时给一家叫Gist-Brocades (GB)的生物公司当咨询顾问。1987年,GB公司请他为公司一套新的污水厌氧处理系统的硫循环做技术指导。这套系统本来是要用来解决工厂产生的臭气问题的。

但在此期间,GB公司的运行人员却发现系统中一个奇怪现象——中试运行数月后,反硝化反应池的氨氮浓度下降了,硝酸盐也减少了,还有明显的氮气产出。“书里不是说氨氮只能在好氧条件才会转化吗?反硝化池的氨氮浓度应该保持不变才对啊?”时任GB公司研究员的Arnold Mulder对此十分不解。他通过领导找到了 Kuenen教授进行咨询。

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图:1984年的Gist Brocades 青霉素制药厂 | 图源: ANP


Mulder先生的发现唤起了Kuenen教授尘封了10年的记忆,他告诉Mulder:“我10年前就看过一篇paper报道过这个现象。” Kuenen教授指的是1977年67岁的奥地利理论化学家Engelbert Broda写的题为《Two kinds of lithotrophs missing in Nature》(德语原题《Zeitschrift für allgemeine Mikrobiologie》)的文章。此文在当时学术圈可谓一声惊雷。当时37岁的Kuenen也拜读了这篇文章,并和同事们展开讨论,但他们大都认为氨是不可能在厌氧条件下被氧化的。

两人开始了进一步的研究。很有商业意识的Arnold很快给这个潜在工艺起了一个朗朗上口的名字——ANAMMOX(厌氧氨氧化)。然而,他们初期的尝试并不算成功:他无法通过传统的培养富集法提取出这个反应发生的微生物,因此无法确定这是一个自发的化学反应,还是一个生物反应。 

Kuenen此时又想起了奥地利人Broda的文章里列出的两条热力学方程式:

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Kuenen教授提议用15-N同位素示踪技术来确认氮气是否来自氨氮,并将此重任交给了他的一位女硕士生——Astrid van de Graaf。Astrid在实验室用流化床反应器做实验,成功发现了14,15-N2。这个发现固然让人激动万分,但他们还需要北京十一选五的证据来充分印证这个反应的生物属性。

幸运的是,Kuenen教授向荷兰技术基金会(STW)申请到资金为Astrid专门开设一个博士项目,确保后者可以安心将研究进行下去。

在证明生物反应的存在后,Astrid接下来要继续用15-N示踪标记法识别各种中间物和最终产物,并尝试富集反应的微生物。这项工作的挑战巨大,别的不说,单考虑到Anammox菌超慢的生长速率(约0.001-0.002/h),Astrid的工作量就可想而知。她的勇气也值得钦佩。幸好皇天不负有心人,在一次偶然的尝试中,他们发现anammox反应的基质是亚硝酸盐,而不是硝酸盐,而且部分亚硝酸盐会转化成硝态氮用于固定二氧化碳。

第一个20年

Kuenen教授在1980年入职TU Delft后的20年可以算是厌氧氨氧化的第一个20年。这个阶段以验证anammox为焦点,在热力学方程式为指导,最终通过富集培养、流化床反应器、同位素示踪标记等手段证明了anammox的存在,并描绘了基本的代谢路径。

Astrid在完成她的博士学位后,并没有选择继续anammox的研究,1994年,在Delft当了6年研究员之后,她选择到荷兰科学中心NEMO做科普内容方面的工作。Kuenen教授将下一个挑战交给了Marc Strous博士,让他对anammox菌进行富集提纯。利用SBR反应器,Marc成功地可重复地培养高产量的anammox菌,纯度提高至70%。

有了高纯度的微生物,Kuenen教授的团队可以做北京十一选五分析了。他找到澳洲昆士兰大学的分子生物学教授John Fuerst帮忙确认目标微生物。借助电子显微镜的近距离观察,他们发现这些细胞有一个奇怪的、靠膜隔开的内室。这可是一个大惊喜!要知道,只有更复杂(真核)细胞才有这种隔室,就像人类细胞拥有的细胞器(organelles)。

他们将这个东西取名厌氧氨氧化体(anammoxosome)。这些细胞器负责执行特定的生物学功能,对细胞组分、代谢过程和信号传导途径起时空控制作用。简单的原核细胞和细菌都没有细胞器。目前科学家只知道浮霉菌(Planctomycetes)具有这种结构,因此研究团队推断anammox菌属于该门。

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图:anammox细胞的透射电子显微镜照片和截面手绘图(比例尺0.2μm)


话说浮霉菌非常奇特,因为它同时含有细菌、真菌和古菌三大菌属的特性,因此有些人认为该菌在早期可能跟三大菌属是同一个祖先。只是DNA的研究将它们归在了细菌属一类。可以说,浮霉菌的出现模糊了细菌的定义。

在此之前,没有人将浮霉菌门跟厌氧氨氧化拉上关系,但Kuenen教授的团队用氨氮和亚硝态氮培养出了这种细胞,底物也随反应过程消失。这也从侧面说明anammox菌的特别之处。

这个说个题外话:他们将这个第一次测序分析的anammox菌取名Candidatus Brocadia anammoxidans:anammoxidans表示其独特的生化特性,Brocadia既表示了这些细菌的发现地(Brocades),另外也因为这些鲜红色的细菌让研究者联想到明艳的织锦。

第二个20年

“21世纪是生物的世纪。”这句话虽然北京十一选五被拿来揶揄,但在我们看来,到本世纪再来看,它所表达的可能就变成真知了。就以anammox为例,在2000-2020年之间,关于它的许多新发现都有赖于生物技术的进步。

16S rRNA基因测序的普及帮助科学家对北京十一选五的anammox菌进行命名。例如Mike Jetten和Michael Wagner就说服法国基因测序中心Genoscope帮Kuenen团队在一个流化床反应器的富集物进行DNA,并找出了新的菌种,并以Kuenen的姓命名(Candidatus Kuenenia stuttgartiensis)。测序结果也显示基因组相当大(4.27 Mb),还含有大量细胞色素基因,这也解释了anammox菌呈红色的原因。

这也开启了anammox菌的宏基因组分析时代。随着DNA测序技术的发展,Kuenenia菌的基因组通过Mike Jetten教授带领的团队得到进一步完善。Jetten团队开展大量的生物化学和酶学研究,在anammox的代谢路径方面取得了重大突破。例如通过结构分析发现anammoxosome是能量转化的场所,又例如发现一氧化氮才是许多anammox菌的反应中间物(而不是羟胺)。

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图:Jetten团队总结的anammoxosome的能量代谢流程图


可以说,21世纪以来,厌氧氨氧化研究已经遍及各个方面,从基因组学、蛋白组学、环境和生态微生物学。值得一提的是,虽然实验和分析手段在过去20多年有了很大改进,不过时至今日,科学家依然无法得到纯种的anammox细菌,这也是为什么这些菌目前都以Candidatus命名。Kuenen表示希望他的学生以及学生的学生们可以早日得到单菌株,这样就可以摘掉Candidatus的前缀。

没有终点的探索

之前我们提到Mulder先生早在上世纪80年代末就为Anammox工艺注册了专利。但因为anammox菌超慢的生长速率,那个年代的人对anammox技术的前景并不看好,压根没有公司感兴趣!唯独Mark van Loosdrecht教授叫他的学生Udo van Dongen试着去搭一个两段式的反应系统,第一段将部分氨氮氧化成亚硝态氮,第二段是厌氧氨氧化流化床。实验结果成功打动了鹿特丹的Dokhaven污水厂。后者和TU Delft合作进行中试实验,处理厌氧消化池的高浓度氨氮出水。最后的结果如今大家都以知道——侧流厌氧氨氧化工艺已经成为很成熟的工艺。但可能不为人所知的是,Kuenen教授和Van Loosdrecht教授当时可是通过2年多的稳定运行才最终打动鹿特丹市所属的水委会,为这个工艺争取到了工程验证的机会。

Kuenen教授在这篇12页的综述里,将学术界和工程界在1977到2020年里对厌氧氨氧化认知的变化都写了一遍。这是一个关于时间和耐心的故事。43年,说长不长,说短不短。但对于1972年博士毕业、2005年退休的Gijs Kuenen教授来说,厌氧氨氧化几乎贯穿了他的科研生涯。虽然硫氧化菌才是Kuenen教授的挚爱,但最后让他流芳百世的却是厌氧氨氧化菌(anammox第二个属Kuenenia就以他命名)。

Kuenen教授在文章最后说道:“对作者而言,这个故事就到此为止了。但欣慰的是,微生物学的奇妙旅程仍将继续。”这是一个没有终点的探索。相信在下一个20年,厌氧氨氧化的研究还有很多惊喜值得期待。(来源:IWA国际水协会)



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